穩轉細胞株

貨號：C10000

穩轉細胞株構建

外源基因在細胞中的表達可分為兩大類，一類是瞬時表達，一類是穩定表達。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達到高水平的表達，但通常只持續幾天。后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可*表達目的基因。建立穩定細胞株，一般是根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物對靶細胞進行篩選。抗性標記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），Hygromycin B、G418和puromycin進行選擇性篩選。傳統的穩定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉染后對靶細胞進行篩選， 終獲得從單一細胞擴增起來的穩定細胞株， 該方法陽性率低，周期長，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒感染細胞后需要逆轉錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組以后才能表達。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩定株的方法克服了傳統方法的弊端，可以在短時間內獲得高效率的穩定細胞株。篩選得到的細胞或者可穩定表達目的蛋白，用于蛋白的擴增和富集；或者得到穩定沉默特定基因的細胞株

1.需客戶告知目的基因具體信息，確定穩轉細胞系的類型

2.提供相關的實驗圖片、實驗數據、構建完成的穩轉細胞系

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穩轉細胞株

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是一種經過特定基因修飾的細胞株，可根據實驗所需表達外源基因、進行基因敲除、敲入、以及精確改變基因序列（如點突變）。對比一般瞬轉方法，利用細胞穩轉株開展實驗能夠獲得長期而穩定的特定性狀，因此有助于增強實驗的可重復性。細胞穩轉株除了可用于基因調控研究，也非常適合于長周期的藥物篩選和藥理學研究、重組蛋白和抗通過慢病毒系統或轉座子系統將外源基因表達框穩定整合進靶細胞基因組，實現外源基因在靶細胞的長期穩定表達。對比瞬轉方法，構建過表達穩轉株可避免瞬轉中因轉染效率導致的表達效率不一致的問題。構建好的細胞株中的外源基因不會因為細胞傳代而丟失，可以持續表達特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重復實驗時不需要對細胞重新轉染質粒，大為節省了實驗時間。體生產等實驗。載體家憑借其資源完備的載體定制平臺，通過病毒轉導常規腫瘤細胞的方式可構建多種應用類型的細胞穩轉株。

　　構建CRISPR基因編輯細胞穩轉株是當今研究基因和細胞功能關系的流行工具。通過gRNA引導Cas9靶向靶細胞基因組特定序列的CRISPR基因編輯，如基因敲除、敲入和定點突變，可以從DNA水平修飾靶細胞的基因序列。載體家提供兩種gRNA表達模式，第一種是轉導gRNA/Cas9共表達載體，gRNA和Cas9在細胞株中同時表達。第二種是構建Cas9表達穩轉株，再根據實驗需求導入gRNA表達載體。使用單Cas9表達穩轉株可以獲得更大的實驗靈活性，如導入多個gRNA打靶GOI，或者多個gRNA與多種Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之間進行搭配等。

　　CRISPR基因編輯系統可選擇單gRNA或雙gRNA表達方式。雙gRNA表達載體常用于以下需要兩個gRNA同時打靶的場景：1）雙gRNA引導兩個Cas9 nickase分別打靶靶位點的正反義DNA鏈，形成DSB并獲得比單gRNA更特異的打靶效果；2）通過在形成兩個DSB，實現目標序列的大片段刪除；3）同時打靶兩個不同的基因。雙gRNA表達載體由兩個U6啟動子驅動gRNA的表達。

　　載體家CRISPR基因編輯載體可采用多類方式進行轉導靶細胞。除基因敲入和定點突變常用的gRNA瞬轉Cas9穩轉株的方法外，我們還提供慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、PiggyBac轉座子載體等多種外源基因轉導方式，以滿足體外或體內多樣CRISPR基因編輯實驗需求。

　　采用Tet-on系統進行誘導表達目的基因，雖然可以直接進行質粒瞬轉，但是載體家亦提供該類載體的慢病毒包裝以構建相關的穩轉細胞株。構建好的Tet-On系統細胞株同時表達tTS和rtTA兩種轉錄調控因子,而目的基因的表達可受四環素調控。其中tTS在四環素不存在的情況下會結合目的基因的上游TRE啟動子，抑制目的基因表達。在細胞體系中添加四環素或其類似物后，rtTA進行響應并結合TRE啟動子，激活目的基因表達。

　　shRNA穩轉株一般使用慢病毒或逆轉錄病毒在靶細胞基因組中導入shRNA表達框，實現shRNA在細胞系中的長期穩定表達。不同于siRNA瞬轉，shRNA穩轉株可內源性地穩定表達siRNA效果，不受轉染效率影響，從而獲得更穩定的基因敲低效果。